Оказывает противогрибковое (фунгистатическое, фунгицидное) действие. Антибиотик полиеновой структуры. Имеет в структуре большое количество двойных связей, обусловливающих высокую тропность вещества к стериновым образованиям цитоплазматической мембраны грибов. Вследствие этого молекула встраивается в мембрану клетки с образованием множества каналов, способствующих неконтролируемому транспорту воды, электролитов и неэлектролитов. Клетка теряет устойчивость к воздействию внешних осмотических сил и лизируется. После приема внутрь нистатин практически не всасывается в ЖКТ и поэтому резорбтивное действие не выражено.
Активен в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida и аспергиллы. Оказывает фунгистатическое, а в больших дозах - фунгицидное действие. Толерантность к нистатину чувствительных грибов развивается очень медленно.